CRISPR-KO-attP-KI
利用CRISPR基因编辑技术对目的序列进行敲除的同时,引入attP位点,后续再通过attP-PhiC31的方法插入新的修改后的回补序列或者外源序列。
技术特点:
◉ CKOAKI技术方案采用先敲除,后回补的两步法,用更灵活的基因编辑,更低的成本实现多种复杂高难度的基因编辑需求:如基因敲除表型挽救、相似度较高同源基因替换、 多位点基因突变构建、多序列和复杂序列插入、插入FRT序列实现条件敲除等;
◉ 芳景生物可提供定制化的高效CKOAKI方案,设计相应的成本最低,效率更高,以获得契合客户研究需求的果蝇品系。
技术流程:
① 制备gRNA,cas9mRNA和donor质粒DNA(同源臂+attP-RFP),混合为注射样品;
② 注射野生型果蝇,获得目标基因组序列被精确敲除并替换为attP-RFP的果蝇品系;
③ 将目的插入序列克隆到attB donor载体,制备donor DNA样品;
④ 注射到前一步获得的attP-RFP果蝇品系中,通过PhiC31介导将目的序列整合到attP之间,获得由目的序列替换原基因组序列的最终果蝇品系。
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图1. CRISPR-KO-attP-KI 示意图