芳景生物

技术服务

01 / 非黑腹果蝇基因编辑

芳景生物目前已经在D.simulans，D.yakuba，D.virilis，D.suzukii 等多个非黑腹果蝇物种中，获得了CRISPR基因编辑品系。

技术流程

① 方案设计：根据客户提供的果蝇物种名称，基因名称，精确序列等必要的信息，芳景生物制定出相应的CRISPR-indel方案；

② 样品制备：先进行靶向序列测序确认，再用自研方法体外合成gRNA和cas9mRNA，获得高效的RNA样品；

③ 显微注射：将待编辑果蝇物种扩繁到一定数量，并饲养到最佳状态，收取高质量的胚胎，至少注射500~600个胚胎保证效率；

④ 杂交鉴定：将注射原代P0与P0子代F1进行双轮杂交与分子鉴定，获得阳性F1代，并将其子代F2进行分子鉴定；

⑤ 构建纯合：将阳性F2代杂合果蝇雌雄自交，鉴定获得纯合的子代F3，将纯合果蝇雌雄自交构建获得纯合品系。

与黑腹果蝇相比存在的技术难点与解决方法

技术难点	解决方案
饲养条件与黑腹果蝇不尽相同，常规条件下，果蝇生长状态不佳	开发了多种培养基，以便对不同果蝇物种进行最佳饲养条件摸索
基因编辑效率不确定	研发了高效的gRNA和cas9mRNA样品，整体提高基因编辑效率
没有平衡染色体工具果蝇，获得阳性之后，较难做成纯合品系	建立了成熟高效的鉴定杂交方法，更加方便快速的获得纯合品系
如果无法获得纯合品系，则突变基因的保存不稳定	保证果蝇存活的情况下进行分子鉴定，更有效富集杂合突变品系

服务流程

实验步骤	内容	周期(月)
target测序	通过PCR测序确定注射昆虫品系的靶序列，保证gRNA序列正确并进行有效切割	0.5
gRNA和cas9合成与样品制备	利用优选的效率评估方法，每个靶位点设计两个gRNA，利用T7体外转录合成gRNA；采用优化的cas9-DNA质粒模板序列，通过mRNA体外转录试剂盒，合成cas9-mRNA；
gRNA和cas9合成与样品制备	配制gRNA+cas9mRNA样品
显微注射	将昆虫饲养到可以注射的数量和状态，收取胚胎，对胚胎注射RNA-mix(gRNA+cas9-mRNA)，注射500-600个胚胎进行后续杂交鉴定	不定，根据生活史1~2代时间
P0杂交和分子鉴定	将P0幼虫做活性检测确定阳性情况，出成虫后与WT杂交，杂交成功后提取P0基因组进行PCR测序检测确认阳性率	不定，根据生活史，3~4代时间+鉴定时间
阳性鉴定与杂交	将阳性P0的F1子代进行鉴定，将阳性的F1成虫自交；
阳性鉴定与杂交	如果F1代阳性数量少，则将F1与WT杂交进行扩增，后代F2杂合成虫自交
构建纯合品系	将F2(或F3)子代鉴定纯合，阳性的纯合成虫雌雄自交；
构建纯合品系	如果无法纯合，则直接交付杂合品系
合计

02 / 其他昆虫基因编辑

芳景生物致力于其他昆虫物种基因编辑平台的搭建和开发，希望通过基因编辑技术的经验和优势，通过借鉴客户的饲养经验，不断开发和建立新的昆虫物种基因编辑平台。

技术流程

① 项目可行性评估：根据客户提供以及自行查阅的相关文献资料，确定基因编辑难度，评估项目可行性；

②繁饲注射预实验：获取物种，根据资料并结合现场条件，进行繁饲和注射方法的摸索与优化，直到获得稳定可靠的相关实验结果；

③正式立项与开展：参考预实验所建立的方法，并部分借鉴非黑腹果蝇基因编辑的流程，开展项目，最终获得目的基因编辑品系。

成功案例

芳景生物目前具备实蝇(B.dorsalis )、家蝇(M.domestica )、飞蝗(L.migratoria )、玉米螟(O.furnacalis )等昆虫物种的基因编辑能力，并致力于与各高校和科研院所合作，搭建更多昆虫物种的基因编辑平台。

B. dorsalis M. domestica L. migratoria O. furnacalis